段欣绿植

三步法pcr退火温度一般是多少(为什么pcr退火温度不能过高)

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用叔姗 2024-07-10 20:22:11

2、 退火温度通常随引物Tm值(常为55-60℃)设定,延伸温度则普遍用72度(Taq酶,也就是DNA聚合酶活性最高的温度)。 因为这三个步骤,我们也可以称它为三步法程序。 相对应的,在qPCR实验中,我们最常见的是两步法程序,①变性,②退火+延伸。

1、 1、步骤不同:两步法退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,而三步法则分两次完成。 2、用时不同:两步法减少一次升降温过程,提高了反应速度,用时较短。 而三步法则比两步法用时更长。

3、 1、退火温度低于引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃。 退火温度需要从多方面去决定,一般根据引物的Tm值(Tm值=4(G+C) +2(A+T))为参考,根据扩增的长度适当下调作为退火温度。 然后在此次实验基础上做出预估。 退火温度对PCR的特异性有较大影响。 2、延伸时间:1min/kb(10kb内)。